农杆菌转化法中,Ti质粒中的T-DNA是如何插入目标染色体的DNA中的?

农杆菌转化法中,Ti质粒中的T-DNA是如何插入目标染色体的DNA中的?

18世纪,人们发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病,该病在葡萄和果树上曾大面积发生。

于是,人们“顺藤摸瓜”找到了一种可植入植物细胞的细菌——农杆菌,它能在自然条件下能趋化性地感染大多数双子叶植物或裸子植物的受伤部位,并诱导植物产生冠瘿瘤。

1974年Zaenen等在根癌农杆菌内发现并分离了一种与肿瘤诱导有关的大型质粒(大于200kb),称为Ti质粒。

1977年Chilton等在研究农杆菌侵染后形成的植物肿瘤细胞时,发现在植物肿瘤细胞中存在着农杆菌Ti质粒的一个片段,称为T-DNA(Transfer-DNA)

这说明,Ti质粒中的T-DNA能够整合到植物细胞的染色体DNA上,这个过程是如何发生呢?

Ti质粒有两个重要区域:T-DNA区(是质粒上能够转移整合入植物受体基因组)和35kb的Vir区(毒性基因)[1]。

1.吸附:农杆菌染色体致病区的两个独立转录单位chvA和chvB参与了农杆菌转化过程,其中chvB的产物与农杆菌表面2-环-β-葡聚糖的合成有关,是保证农杆菌吸附于植物细胞所必不可少的成分[3]。

2.产生T-DNA拷贝:受伤植物伤口分泌的酚类小分子化合物可以诱导Vir基因的表达,进而诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。

3.加工与转移:T-DNA单链分子从Ti质粒上脱离后,可以与Vir的表达产物VirD2蛋白质共价结合,并在VirD2和VirD4、VirE2蛋白(含核定位序列)等蛋白的帮助引导下穿过农杆菌的内膜、外膜、细胞壁、植物细胞的细胞壁、细胞膜、以及核膜。

4.整合:在T-DNA的两端边界处各有一个25bp长的高度保守正向重复序列(LB,RB),只要这两端序列存在且方向正确,T-DNA就能以单拷贝或多拷贝的形式随机整合到宿主细胞染色体DNA上[1]。

5.T-DNA表达、植物发病

农杆菌这一特殊技能被用于基因工程中,而农杆菌转化法是植物基因转化最为普遍的方法,具体操作过程如下

对天然Ti质粒进行改造,切除T-DNA区上与肿瘤形成有关的基因,同时插入外源目的基因,利用重组Ti质粒转化农杆菌,使农杆菌携带外源目的基因。

将人为造成伤口的叶片小块浸入这样的农杆菌菌液中,农杆菌侵染植物细胞,同时让外源目的基因转移到植物细胞的染色体上并有效表达。

最后,将被农杆菌侵染的叶片在含有抗生素的培养基上培养,被转化的植物细胞形成愈伤组织,再进一步分化发育成完整的转基因植株[2]。