酵母双杂交系统原理是由Fields和Song在研究真核基因转录调控时建立的技术体系，其基础在于转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域可分离并重建功能。该系统通过将测试蛋白分别与两类载体（含DNA结合结构域或转录激活结构域）融合表达，当蛋白相互作用时可使转录因子功能重建，从而激活报道基因表达。
该系统以改造后的酵母细胞作为报道株，具有质粒易转化回收、内源性蛋白干扰少等特性。其检测灵敏度源于高拷贝表达载体、自然平衡条件下的信号维持、转录复合体稳定性增强以及报道基因产物的信号放大效应。通过lacZ等报道基因的表达分析，可实现蛋白质相互作用在活细胞内的直接观测。
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